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2016年HPLC热门话题预测——为什么有效的HPLC分离对于高复杂系统的分析是至关重要的?
发布:kittyll   时间:2016/4/13 16:28:18   阅读:732 
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在今年6月19日至24日美国旧金山举办的HPLC 2016大会上,首先就会有四分之一的篇幅都在探讨分离科学当前的主题。
 

大规模蛋白质生物化学,或称为蛋白质组学,是指“一种基因组所表达的全套蛋白质”。串联质谱仪的数据库搜索可用于研究序列,即将实验获得的图谱和数据库中酶切肽段的理论图谱进行比对,找出数据库中与实验图谱最匹配的肽段或蛋白质。
 
当然这些方法首先要将蛋白复合物、细胞器和全细胞等水解消化使蛋白质变成肽,然后再用串联质谱法(MS/MS)进行定性分析。这一操作的本质就是创建了一个非常大而复杂的肽的混合物。
 
而在电喷雾电离时,不同集合的肽会形成离子抑制;那么当务之急便是分离肽以缓解离子抑制并允许质谱仪有足够的时间来收集串联质谱产生的肽离子。因此,肽的分离方法是蛋白质组学研究的关键。所面临的挑战也是前所未有的。
 
 
来自人类细胞蛋白质的消解可以产生几十万种肽。采用串联质谱仪分离如此复杂的混合物,其分析结果取决于两个方面:仪器的分辨率和扫描速率。
 
分离分辨率要做的就是尽可能地降低混合物的复杂性,以便仪器可以最大限度地收集肽离子的串联质谱信息。而串联质谱仪扫描速率提高的话,则可以在单位时间内更多地收集图谱信息。新的数据采集方式如“data-independent数据采集”等就是要进一步提高数据采集效率。很显然,这种情况下分离问题就成为了一个具有挑战性的问题,特别是减少分析所需的总时间这个关键点。
 
最初用来分离复杂的肽混合物的方法是二维液相色谱(2D LC)技术,通过采用C18柱[1,2]实现强阳离子交换和反相二维分离。这两种模式虽然未达到完全正交,却提供了很好的峰面积;但这个方法的缺点就是需要耗用很长的分析时间来实现大量蛋白质的鉴定。
 
 
除此之外,各种二维方法相继诞生,其中包括碱性(高pH)反相分离串联酸性(低pH)反相分离技术,以及类似于强阳离子交换-反相分离法的强阴离子交换-反相分离方法等[3]。
 
通过不断改进,现在质谱技术已经可以用于大多数哺乳动物的细胞蛋白质组的分析。事实上,已有文献报道了采用反相高效液相色谱法(HPLC)分析一个近乎完整的真核酿酒酵母蛋白质组[4],所用分析时间为90 min。通过缩短分析时间,我们可以设计出更高效的试验方法,以便实现在面对更多样本条件或更多患者样本的检测。超高效液相色谱(UHPLC)技术为我们提供了一个新的方向,它使用C18色谱柱,这是一种新的高分辨率、单维分离技术;虽然目前对于复杂的蛋白质组来说,要实现大量的肽的鉴定仍需要4-8 h[5,6]。
 
另一个可以提高分辨率、增加峰面积的因素是提高分离的动态范围。因为在一个蛋白质组内至少有106种表达蛋白,这还不包括翻译后修饰(PTMs)的形式。单维UHPLC的分离能力最终是否能延伸到捕获所有哺乳动物细胞的蛋白质组的细微之处乃至每个蛋白质结构的细微差别,还有待观察。所以,开发高速2D LC分离技术是实现这一目的的另一种手段,但是这类方法有好的分离效果的同时,总是伴随着漫长的分析时间,因此提高分析时间就是2D LC所面临的一个挑战。
 
 
分离技术与先进的质谱技术联用,大大地提高了我们解读整个人类蛋白质组的能力,因此推进该技术不断进步、达到更多的高序列覆盖率是至关重要的。高序列覆盖结合良好的动态范围将实现差异表达的蛋白质形式和PTMs信息的全面收集,这对于了解蛋白质的功能信息是至关重要的。
 
参考文献:
 
[1] A.J. Link et al., Nat. Biotechnol. 17, 676–682 (1999).
[2] M.P. Washburn, D. Wolters, and J.R. Yates, Nature Biotechnology 19, 242–247 (2001).
[3] M. Gilar, P. Olivova, A.E. Daly, and J.C. Gebler, Anal Chem 77, 6426–6434 (2005).
[4] A.S. Hebert et al., Mol. Cell Proteomics 13, 339–347 (2014).
[5] Q. Luo et al., Anal. Chem. 77, 5028–5035 (2005).
[6] J.E. MacNair, K.D. Patel, and J.W. Jorgenson, Anal. Chem. 71, 700–708 (1999).


图片来源于网络

作者:John Yates
译自:chromatographyonline
来源:材料与测试
译者:兔子小光

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