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快速、简单地测定啤酒中的自由氨基酸
发布:shadow   时间:2015/5/14 11:05:11   阅读:1160 
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啤酒是世界上最受欢迎的饮料之一。基于啤酒属于一种天然产品,故为了保证对其味道、颜色和组成进行有效的质量控制是具有挑战性的。分析啤酒中的氨基酸可以用来确保最终产品质量,同时也作为辨识品牌产品真假的指标。本文提出一种快速、可靠的测定啤酒中氨基酸的方法,即采用高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)测定。
 
啤酒是世界上最受欢迎的饮料之一,每年全世界的消耗量约为2×1011L。市售的啤酒口味、风格各异:含酒精与不含酒精的、纯或混合饮料,普通啤酒、清啤酒、小麦啤酒、Alt(老啤酒)和Koelsch(科隆的独门品牌)等等,以上列举的仅是所有啤酒中的一部分而已。除了因为啤酒含有酒精存在一定的风险外,饮用啤酒并不是什么坏事。啤酒是一种易消化的饮品,且它是维生素的重要来源,同时富含钾、镁、磷、蛋白质和其他微量元素,以及自由氨基酸等。
 
材料与测试:快速、简单地测定啤酒中的自由氨基酸
 
制造啤酒的麦芽汁组成很大程度上依赖于原材料和酿酒生产过程中使用的工艺,因为这些液体是在酿造啤酒的打浆过程中提取出来的。
 
尽管酿酒的水、啤酒花和大麦的质量和品质可以为我们所控制,但外界环境的影响会导致一些成分浓度微小变化,因此它的质量:特定的氨基酸对啤酒味道的贡献以及对啤酒丰满度和酒劲的影响就在此刻建立起来。
 
而且氨基酸作为发酵过程的氮源,其重要性是无可争辩的。
 
从大麦谷物成熟收获后到成品啤酒,整个过程中对氨基酸的组成和含量的测定都非常重要的,这与确保最终产品的质量是相一致的。在处理和存储或鉴别假冒品牌产品的过程中,特定氨基酸的定量可以为掺假和退化的迹象提供指示。
 
方法:氨基酸分析

有很多方法可用于氨基酸的分析,例如非衍生化-HILIC法、o-phthalaldehyde(OPA)柱前衍生化-荧光检测法、OPA 柱前衍生化-紫外可见光谱法、离子交换色谱法和柱后衍生化法。本文采用了自动柱前衍生化-在线反相液相色谱分离法,配 UF-Amino Station 系统(日本岛津公司)、LCMS 2020四极质谱仪(日本岛津公司)检测。该自动衍生化的优点在于速度快、效率高,同时有效地减少了人为因素在工作流程中导致的误差。
 
试验试剂:氨基酸分析试剂(Tag氨基酸,LC-MS分析用),氨基酸混合标准溶液,AN-2型、B型、APDSTAG氨基酸混合内标溶液,Tag氨基酸洗脱液,所有的化学试剂来自Wako Chemicals GmbH公司。乙腈(MS级,Promochem)作为流动相B相。氨基酸标准混合溶液浓度:500,300,50,10,2.5μmol/L。
 
材料与测试:图1 衍生化和进样系统流程图
图1 衍生化和进样系统流程图
 
来自不同制造商的五瓶啤酒使用不同的进样针,分别为不含酒精的清啤酒和小麦啤酒,含酒精的清啤酒和小麦啤酒,以及来自德国杜塞尔多夫地区的Alt啤酒。
 
空白样品、校准标准和啤酒样品(过滤后)采用同样的处理方式。用50μL的进样针吸取空白样品(以水为空白)、50μL内标溶液为空白(以水为空白),100μL的乙腈分别注入深井板管进行彻底的混合。
 
自动进样器中预处理过程是自动执行的,在自动进样器中,探针连接着硼酸缓冲溶液和氨基酸试剂,然后进样注入。衍生化反应在60°C完成后,获得的氨基酸衍生物进入色谱柱(2.1×100mm,2.0μm,Shimpack UF-Amino)分离,然后依次用MS检测。
 
上一个样品进行分析的时候,第二个样品开始进行衍生化,这样可以大大地节省试验时间。

分析所得数据使用AmiNavi软件进行处理(日本岛津公司和味之素公司)。输入样本的名字后,创建批次测定所需的标准、空白和样品并通过不同的色彩标明,对应其在深井板中的位置(图2)。
 
材料与测试:图2 批处理中,用不同颜色标出的样本
图2 批处理中,用不同颜色标出的样本

结果与讨论

根据预设的再加工方法为每个分析物建立校准曲线。必要时需要将单个化合物整合在一起进行验证和手动校准(图3)。概述表中给出了本法分析的五种啤酒中的38个氨基酸的定量结果,并显示了它们的色谱数据。
 
材料与测试:图3 校准曲线
图3 校准曲线
 
五种啤酒中氨基酸的含量见表1。图4为一个典型的氨基酸混合标准溶液的高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)图。啤酒的不同在于氨基酸的模式。总氨基酸含量最高的是无酒精啤酒(8074 μmol/L和7117.6 μmol/L),其次是清啤酒(6910 μmol/L)。氨基酸含量最小的为小麦啤酒(5238μmol/L)。由38种氨基酸的分析结果可知,无酒精小麦啤酒中有11种氨基酸的浓度显著高于其它样品。五种啤酒可以分成三个不同的口味组:苦味氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、精氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸);甜味氨基酸(丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸);和酸味、甘味氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)。五种啤酒中最丰富的氨基酸为丙氨酸(242-744μmol/L)和脯氨酸(1943-3402μmol/L),这正是由于酵母发酵过程中脯氨酸不被吸收的缘故。
 
材料与测试:表1 啤酒样品中氨基酸含量测定结果(单位μmol/L)
表1 啤酒样品中氨基酸含量测定结果(单位μmol/L)


结论
 
本文建立了一种快速、可靠的自动柱前衍生-HPLC-MS法测定38种氨基酸的方法,测定时间仅需9min(总运行时间12min)。
 
材料与测试:图4 38种衍生化氨基酸的SIM图
图4 38种衍生化氨基酸的SIM图
 
自动衍生化即快速、高效,又减少了样品制备过程中人为误差。采用本法38种游离氨基酸在9分钟内完成测定;而如果采用柱后衍生的化则需要1~2小时。相交之同类报道的柱前衍生法,检测出的氨基酸种类更多,其他方法通常为20-25种。
 
本法衍生过程的再现性良好,这可以从5点校正曲线的相关系数R 2≥0.99看出。氨基酸在啤酒中的含量取决于啤酒制备过程采用的材料和技术,而氨基酸的含量却在一定程度上决定了啤酒的营养价值、品质和啤酒的稳定性。五个啤酒样品中氨基酸的总含量在5238-8074 μmol/L之间,不同种类的啤酒其氨基酸分布呈现显著性差异。
 
作者:Gesa J. Schad和Brigitte Bollig


来源:材料与测试
译者:兔子小光
译自chromatographyonline
 
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